Análisis de PCR

T: Un RT-PCR en tiempo real de tetraplex de nuevo desarrollo para la detección simultánea de los tipos de virus de influenza A, B, C y D

O: Desarrollar  una herramienta de diagnóstico rentable para programas de vigilancia a gran escala dirigidos a los cuatro tipos de virus de influenza mediante la transcripción reversa en tiempo real - reacción en cadena de la polimerasa (rRT-PCR).

MB: Frotis nasales, tejidos pulmonares, fluidos orales y un lavado de pulmón.

AN: ADN genómico

G: Gen que codifica para la Hemaglutidina y Neurominidasa

Tipo de PCR: Reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR)

Pasos: Dado que el ARN usualmente es de una sola hebra es necesario hacer una transcripción reversa (RT) antes de iniciar la amplificación por PCR. 

Los pasos de la RT-PCR son:

Transcripción reversa: Unión del partidor a la secuencia de ARN objetivo.

Transcripción reversa: La polimerasa rTth cataliza la extensión del partidor mediante   la  incorporación de nucleótidos complementarios.

Fin de transcripción reversa: Se obtiene la hebra del cADN complementario al ARN

Desnaturalización: 95 °C por un minuto

Anillamiento: 54 °C por varios segundos

Extención: 72° C a 2 minutos

Especificidad analítica: Los seleccionados de cebadores y sondas se evaluó en una amplia gama de cepas de influenza y virus respiratorios distintos de la influenza. Se encontró que el conjunto H2-2 tiene una especificidad insuficiente para detectar virus de influenza A estacional (H1N1) y fue excluido de un análisis posterior. Mientras que el conjunto NA tiene una especifidad alta para detectar los virus B y C.

Sensibilidad analítica: El límite de detección para los cebadores-sonda fue de 3,2 (IC95%: 3,07). -3.48) lg EID50 / ml. Se utilizaron estándares basados ​​en copias para determinar el límite de detección del tetraplex RT-qPCR. Se evidenció un LOD de 10 copias de objetivos para los cuatro objetivos cuando solo estaba presente uno de los cuatro objetivos.

Análisis del límite de detección del ABCD tetraplex RT-qPCR basado en el valor medio de las diluciones seriadas por triplicado de 10 veces el ARN viral transcrito que la respuesta de 10 8 a 1 copias / reacción (A1 - D1)

Referencia Bibliográfica

1. https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1111/irv.12613