Terapias de Edición Genómica para la Influenza

Terapia génica que protege a los ratones de cepas de gripe 

pandémica (H1N1)

La siguiente terapia génica somática In vivo utiliza un virus adenoasociado (AAV, por sus siglas en inglés) que sirve como un transportador  de genes que codifican los anticuerpos de la gripe hacia las células que recubren las vías respiratorias de las personas. Las células epiteliales producirían anticuerpos contra la influenza en el lugar donde el virus intenta establecer una infección. Utilizaron un raro "anticuerpo ampliamente neutralizante", capaz de combatir muchas cepas de influenza. Cuando administraron este virus en la nariz de ratones y hurones, las células epiteliales de los animales produjeron los anticuerpos deseados; luego "desafiaron" a los animales con una variedad de virus de la influenza: H5N1 y  H1N1. Los anticuerpos brindaron una sólida protección. El tiempo es de  aproximadamente de 3 meses en un experimento con monos porque las células epiteliales de las vías respiratorias en las que se basa el método se desprenden continuamente.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS:

1. https://www.sciencemag.org/news/2013/05/gene-therapy-against-flu

TERAPIA CON STEM CELLS PARA LA INFLUENZA

TERAPIA CON STEM CELLS PARA LA INFLUENZA

Las células mesenquimales son multipotentes, auto renovadoras que secretan citoquinas antiinflamatorias, lípidos mediadores y factores de crecimiento.  Las MSC derivadas de la médula ósea pueden proporcionar un beneficio terapéutico a los seres humanos con enfermedad pulmonar grave causada por virus de la Influenza, especialmente en los pacientes mayores, que tienen un mayor riesgo. Las MSC reducen significativamente el deterioro del aclaramiento del líquido alveolar inducido por la infección por A  in vitro y previenen o reducen la lesión pulmonar aguda asociada a influenza in vivo. 

Referencias Bibliográficas
1. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4822574/
2. https://www.atsjournals.org/doi/abs/10.1164/ajrccm-conference.2014.189.1_MeetingAbstracts.A5285

Transgénico vegetal contra la Influenza

Nitraria schoberi L. cultivo de raíces vellosas como fuente de compuestos con actividad antiviral contra los subtipos de virus de la gripe А

El cultivo de raíces vellosas de halophyte Nitraria schoberi se obtuvo transformando las hojas primarias de las plántulas con una cepa silvestre de Agrobacterium rhizogenes. Después,  de 20 días de cultivose observóque las raíces se alargaron y tenían plagiotropía , una característica morfológica de una modificación genética exitosa. El estado transgénico de las raíces se confirmó mediante análisis de PCR usando rolB -, rolC -, virC -, virD1- cebadores específicos.

Los compuestos metabólicos estudiados en el cultivo fue el etanol puesto que posee alta actividad antiviral contra los subtipos del virus de la influenza A. Esto se ha demostrado en células MDCK y en ratones infectados que han aumentado su supervivencia y esperanza de vida.

Referencias Bibliográficas
https://link.springer.com/article/10.1007%2Fs13205-018-1280-5

https://link.springer.com/article/10.1007/s13205-014-0266-1

VENTAJAS DE LOS TRANSGÉNICOS

• La fabricación de fármacos de  algunas proteínas provenientes de organismos transgénicos (proteínas recombinantes) para tratar distintas enfermedades lo que permite reducir los costos y hacer el tratamiento más asequible y accesible para la población con menos recursos.
• Modificar los vegetales con el fin de retardar la maduración mediante la neutralización del gen encargado de producir esa hormona. De este modo es posible que la fruta se conserve durante más tiempo, alargando la vida útil y reduciendo así la pérdida de alimentos.
• Los transgénicos pueden ayudar a garantizar la seguridad alimentaria en los países en vías de desarrollo.
• En la producción de alimentaria, los transgénicos mejoran la calidad nutricional. Un ejemplo: es el arroz dorado (golden rice) rico en beta-caroteno, un precursor de la vitamina A, esta vitamina ayuda a prevenir enfermedades y a evitar la ceguera.
• Protección del medio ambiente que participan en la conservación de los recursos naturales. Se han desarrollado vegetales modificados genéticamente con mayor capacidad de asimilación de metabolitos contaminantes mediante la alteración de genes implicados en su asimilación o en su degradación.

DESVENTAJAS

• La transferencia de genes puede traspasar alérgenos generando alergias en los individuos que consuman el trasngénico.
• Aumentar la producción de toxinas o la expresión de las mismas en lugares en los que anteriormente no se encontraban al provocar una alteración del material genético de estos microorganismos.
• En muchos de estos productos, se utilizan genes de resistencia a antibióticos como marcadores y se postula que al consumir el alimento transgénico, pasen al humano confiriendo resistencia, lo que dificultaría el tratamiento de las enfermedades infecciosas.
• En manos del sector privado está el control total de estos nuevos alimentos, lo que supone que los agricultores tengan una importante dependencia de las empresas biotecnológicas para desarrollar su actividad.
• La pérdida de biodiversidad también suele estar asociada al cultivo de transgénicos por diversos motivos: los cruzamientos de genes, la sustitución de la vegetación autóctona por cultivos modificados , debido a la competición entre especies, o por efectos dañinos sobre los insectos.

Referencia bibliográfica

https://revistas.ucm.es/index.php/OBMD/article/viewFile/57946/52140

ADN recombinante en la naturaleza y ADN recombinante artificial en Neumonía por influenza

ADN RECOMBINANTE EN LA NATURALEZA

Las bacterias sufren varias tipos de recombinación que hace posible la transferencia de genes entre especies no afines. Un proceso conocido como la transformación permite que las bacterias capturen DNA libre del ambiente. También puede haber transformación cuando las bacterias capturan diminutas moléculas circulares de ADN llamados plásmidos.

La gran abundancia de genes de origen bacteriano en el genoma nuclear de P. purpureum ha sido de gran interés por ello han secuenciado ese genoma demostrando  un sistema de transformación genética que parece exhibir una tasa relativamente alta de recombinación homóloga. El mantenimiento del plásmido en P. purpureum. depende de los orígenes bacterianos de la replicación y, por lo tanto, representa un caso interesante de intercambio de ADN y compatibilidad genética entre dos dominios diferentes de la vida (bacterias y eucariotas). Por lo tanto, proponemos que la presencia frecuente de plásmidos en las algas rojas  podría explicarse por la compatibilidad de los sistemas de replicación de plásmidos en bacterias con la maquinaria de replicación de ADN que opera en el núcleo de algas rojas.

ADN RECOMBINANTE ARTIFICIAL

Una nueva vacuna contra la influenza A se realizó mediante la fusión genética de los aminoácidos 2–16 de M2e (proteína matriz 2) del virus  al extremo N de la proteína pVIII de la cubierta principal para generar fagos híbridos que contienen capsómeros. Los fagos f88 − M2e2-16 recombinantes resultantes que forman una estructura helicoidal alrededor del ADN genómico circular monocatenario no matan a su huésped, sino que se comportan como una infección persistente que frena el crecimiento bacteriano, con nuevos fagos que brotan continuamente de la E. coli. La inmunización con f88M2e2-16 indujo niveles de anticuerpos protectores mejorados dramáticamente después de la segunda y tercera inyección y confirió una protección completa.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
1. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6110788/
2. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4431709/
3.https://espanol.cdc.gov/enes/flu/protect/vaccine/qa_flublok-vaccine.htm
4. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK21881/

Microarray de Influenza

Genotipado y detección de virus de influenza de origen aviar y humano comunes mediante un microarray de imágenes de quimioluminiscencia portátil

Los virus de la influenza se dividen en tres tipos, A, B y C. Los virus de la influenza humana A y B pueden causar epidemias estacionales, pero la influenza C causa solo una enfermedad respiratoria leve. El virus de la influenza A puede infectar varias especies hospedadoras. En 2013, la influenza aviar A (H7N9) infecciosa para humanos se reportó por primera vez en China. Para la segunda semana de 2014, había 210 casos humanos confirmados por laboratorio en el país, y la tasa de mortalidad llegó a un 22%. El diagnóstico rápido y preciso de los virus de influenza es importante para el manejo clínico y la epidemiología.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5080273/

Análisis de PCR

T: Un RT-PCR en tiempo real de tetraplex de nuevo desarrollo para la detección simultánea de los tipos de virus de influenza A, B, C y D

O: Desarrollar  una herramienta de diagnóstico rentable para programas de vigilancia a gran escala dirigidos a los cuatro tipos de virus de influenza mediante la transcripción reversa en tiempo real - reacción en cadena de la polimerasa (rRT-PCR).

MB: Frotis nasales, tejidos pulmonares, fluidos orales y un lavado de pulmón.

AN: ADN genómico

G: Gen que codifica para la Hemaglutidina y Neurominidasa

Tipo de PCR: Reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR)

Pasos: Dado que el ARN usualmente es de una sola hebra es necesario hacer una transcripción reversa (RT) antes de iniciar la amplificación por PCR. 

Los pasos de la RT-PCR son:

Transcripción reversa: Unión del partidor a la secuencia de ARN objetivo.

Transcripción reversa: La polimerasa rTth cataliza la extensión del partidor mediante   la  incorporación de nucleótidos complementarios.

Fin de transcripción reversa: Se obtiene la hebra del cADN complementario al ARN

Desnaturalización: 95 °C por un minuto

Anillamiento: 54 °C por varios segundos

Extención: 72° C a 2 minutos

Especificidad analítica: Los seleccionados de cebadores y sondas se evaluó en una amplia gama de cepas de influenza y virus respiratorios distintos de la influenza. Se encontró que el conjunto H2-2 tiene una especificidad insuficiente para detectar virus de influenza A estacional (H1N1) y fue excluido de un análisis posterior. Mientras que el conjunto NA tiene una especifidad alta para detectar los virus B y C.

Sensibilidad analítica: El límite de detección para los cebadores-sonda fue de 3,2 (IC95%: 3,07). -3.48) lg EID50 / ml. Se utilizaron estándares basados ​​en copias para determinar el límite de detección del tetraplex RT-qPCR. Se evidenció un LOD de 10 copias de objetivos para los cuatro objetivos cuando solo estaba presente uno de los cuatro objetivos.

Análisis del límite de detección del ABCD tetraplex RT-qPCR basado en el valor medio de las diluciones seriadas por triplicado de 10 veces el ARN viral transcrito que la respuesta de 10 8 a 1 copias / reacción (A1 - D1)

Referencia Bibliográfica

1. https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1111/irv.12613

Prueba de tamizaje y confirmatoria de la Influenza

Prueba rápida del antígeno de la influenza (hisopado nasal o faríngeo)

Esta prueba también conocida como prueba rápida de diagnóstico de la influenza o  RID, detecta rápidamente los signos del virus de la influenza A e influenza B en una muestra de secreciones de su nariz o garganta. Para este análisis, se requiere una muestra de flema u otras secreciones de su nariz o garganta. Su proveedor de atención médica usará un hisopo estéril para recolectar la muestra. Otra forma de tomar una muestra requiere un aspirado nasofaríngeo. En este procedimiento, un proveedor de atención médica inyectará solución salina en su nariz y, luego, recolectará la muestra.

RT-PCR

La influenza es un virus que puede detectarse en muchas clínicas a  través de la identificación de ácidos nucleicos como la RT-PCR. La técnica se fundamenta en la propiedad de la transcriptasa inversa para realizar la conversión del RNA a cDNA y posteriormente de la habilidad que tienen las DNA polimerasas para replicar hebras de DNA tras cada fase de replicación.

Cuando la cantidad es limitada, la RT-PCR ofrece mejores posibilidades que el aislamiento. Sin embargo este método depende de secuencias conservadas, por lo que cambios genéticos pueden modificar la sensibilidad del mismo.

Referencias Bibliográficas
http://carefirst.staywellsolutionsonline.com/Spanish/RelatedItems/167,rapid_influenza_antigen_ES
https://espanol.cdc.gov/enes/flu/professionals/diagnosis/table-testing-methods.htm